Днк гепатит б

Днк гепатит б

Effects of Entecavir on Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA in Hepatitis B e Antigen-Positive Patients with Hepatitis B
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4315599/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: MS WLS. Проводили эксперименты: MS YYH BH LS. Проанализированы данные: MS BH LS. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: BH. Написал газету: MS WLS.

Целью этого исследования было оценить влияние 48-недельной терапии энтекавиром на сывороточный и внутрипеченочный вирус гепатита В, ковалентно замкнутые уровни циркулярной ДНК (HBV cccDNA) у пациентов с гепатитом В-антигена (HBeAg). В общей сложности 120 пациентов с HBeAg-положительным хроническим гепатитом лечились энтекавиром в течение 48 недель. Маркеры HBV сыворотки, общая ДНК HBV и уровни CccDNA HBV были измерены в начале и на неделе 48. Биопсии у 20 пациентов были доступны как для внутрипеченочной полной ДНК HBV, так и для оценки cccDNA в эти моменты времени. Уровни ксДНК HBV снижались со среднего уровня 5,1 × 106 копий / мл на исходном уровне до медианного уровня 2,4 × 103 копий / мл на 48 неделе. Редукционные величины ХКВ-ккДНК у пациентов с нормализованными уровнями аланинаминотрансферазы и теми, кто подвергается сероконверсии HBeAg были значительно больше, чем у пациентов с аланинаминотрансферазой — аномальным и HBeAg. Через 48 недель лечения внутриклеточная ВГВ-ккДНК значительно снижалась, но ее нельзя было искоренить. В заключение, лечение пациентов с HBeAg-положительным гепатитом B с энтекавиром в течение 48 недель значительно уменьшало содержание СККД в сыворотке и внутрипеченочной HBV, а величина уменьшения ксДНК HBV была связана с полным снижением ДНК HBV, нормализацией аланинаминотрансферазы и сероконверсией HBeAg.

Все соответствующие данные приведены в документе.

Инфекция вируса гепатита B (HBV) поражает более 350 миллионов человек во всем мире, вызывая острый и хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному [1]. Когда HBV попадает в гепатоциты, частично двухцепочечный, релаксированный круговой ДНК (rcDNA) -го рода будет превращаться в ковалентно замкнутый кольцевой ДНК-фрагмент (cccDNA) в ядре инфицированных клеток [2]. CccDNA обеспечивает матрицу транскрипции для вирусных и мессенджеров РНК, которые кодируют вирусные структурные и неструктурные белки. Особенностью жизненного цикла HBV является то, что геном HBV либо инкапсулирован для получения вирионов, либо секретируется в крови, либо возвращается обратно в ядро ​​для поддержания пула cccDNA, что приводит к накоплению HKV cccDNA в ядрах гепатоцитов на уровне около 5 — 50 копий на клетку во время хронической инфекции [3]. Сохранение cccDNA в гепатоцитах играет ключевую роль в сохранении вируса, реактивации репликации вируса после прекращения антивирусной терапии и устойчивости к терапии [4].

В нескольких исследованиях показано, что CSCDNA HBV обнаруживается в сыворотке пациентов с HBV-инфекцией [5-7], а уровни CccDNA в сыворотке HBV коррелируют с внутрипеченочными уровнями cccDNA [8]. Это означает, что измерение уровней cccDNA в сыворотке частично отражает внутрипеченочные уровни cccDNA, что позволяет проводить последовательную оценку внутрипеченочных уровней cccDNA без необходимости повторной биопсии печени во время антивирусной терапии [8].

Противовирусная терапия значительно снижает уровни СКВК в сыворотке крови. Обработка ламивудином в течение 12 месяцев приводит к двухъядерному восстановлению cccDNA HBV в сыворотке [9]. Комбинированная терапия с помощью пег-интерферона и адефовира приводит к заметному снижению внутрипеченочной ксДНК HBV, что значительно коррелирует с уменьшенным поверхностным антигеном гепатита В [10]. Сорок восемь недель терапии адефовиром снижают внутрипеченочную ккдксу на 0,8 лог-копии / клетку [6]. Тем не менее, исследования в моделях, полученных в лесу, показывают, что уменьшение cccDNA вызвано потерей гепатоцитов, а не уменьшением содержания cccDNA в этих клетках [11], а клинический рецидив после прекращения антивирусной терапии может быть вызван остаточной клеточной HBV cccDNA [ 12].

Энтекавир широко используется для лечения хронической инфекции HBV в Китае. Однако в немногих исследованиях основное внимание было уделено его воздействию на сыворотку и внутрипеченочную ксДНК HBV. В настоящем исследовании мы оценили влияние лечения энтекавиром на уровни сыворотки крови и внутрипеченочной HBV cccDNA у китайских пациентов с гепатитом B e антиген (HBeAg) -положительный хронический гепатит B с использованием анализа полимеразной цепной реакции TaqMan в реальном времени (ПЦР). Этот анализ имеет хороший линейный диапазон, когда 100 -107 копий CccDNA HBV используются в качестве матрицы, в то время как нулевой фон наблюдается с использованием ДНК вирусного генома HBV в качестве матрицы [6].

В общей сложности 120 пациентов с хроническим гепатитом В лечились энтекавиром. Все пациенты старше 16 лет, положительно относятся к поверхностному антигену гепатита В (HBsAg) в течение по меньшей мере 6 месяцев и положительны для HBeAg с уровнем ДНК HBV более 100 000 копий на мл, а уровень сывороточного аланинаминотрансферазы (ALT) чем в два раза больше нормального диапазона. Критерии исключения включали совместную инфекцию вирусами гепатита A, C, D или E или ВИЧ, декомпенсированные заболевания печени или гепатоцеллюлярную карциному, историю злоупотребления алкоголем или наркотиками в течение 1 года до регистрации в исследовании, другие возможные причины хронической печенки повреждение и предыдущее лечение хронического гепатита B. Образцы сыворотки были взяты у всех пациентов в начале и на неделе 48 и хранились при -70 ° C до использования для измерения уровней ДНК HBV и cccDNA. Образцы биопсии собирали у 20 пациентов до и после терапии и хранили при -70 ° C до экспериментального анализа.

HBsAg, поверхностное антитело против гепатита В (HBsAb), HBeAg, антитело против гепатита B (анти-HBe) и антитело к гепатиту B (анти-HBc) измеряли с использованием коммерчески доступных реагентов для иммуноферментного анализа, связанного с ферментом (Kehua Biotech, Shanghai, Китай) в начале и каждые 30 дней после этого. Активность ALT определяли кинетически на автоматическом биохимическом анализаторе Beckman CX5 с помощью диагностического набора Beckman (Beckman-Coulter, Brea, CA, USA). Уровни ДНК HBV тестировали с использованием реагентов PCR реального времени TaqMan (Fosun Diagnostics, Shanghai, China) на ABI 7500 (Life Technologies, Foster City, CA, USA). Нижний предел обнаружения составлял 15 МЕ / мл в соответствии с упаковкой изготовителя. Все используемые реагенты были одобрены Государственным управлением по контролю за продуктами и лекарствами Китая для использования в диагностике in vitro.

Уровни ксДНК сыворотки HBV измеряли с помощью ПЦР в реальном времени, как описано ранее, с небольшой модификацией [6]. ДНК экстрагировали из сыворотки с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Shenzhen, China). Перед амплификацией cccDNA аликвоты каждого образца ДНК обрабатывали плазмидной безопасностью DNase (Epicenter, Madison, WI, USA). Короче говоря, ДНК, экстрагированную из 100 мкл сыворотки, разбавляли водой до 100 мкл. Аликвоту 50 мкл нагревали при 75 ° С в течение 5 мин и сразу же помещали на лед в течение 3-5 мин. Затем ДНК расщепляли 10 единицами плазмид-безопасной ДНКазы в присутствии 1 × буфера и 1 мМ АТФ для разрушения одноцепочечной ДНК, присутствующей в rcDNA. ПЦР в реальном времени проводили на ABI7500 (Life Technologies) с использованием 50 мкл реакционного объема, содержащего 20 нг ДНК (для количественной оценки cccDNA использовали объем, эквивалентный 20 нг до обработки ДНКазой), 2,5 мМ MgCl2, 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров, 0,4 мкМ зонда. Прямые и обратные праймеры были 5′-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3 ‘(nt1549-nt1565) и 5′-CCCCAAAGCCACCCAA-3′ (nt1904-nt1889) для амплификации cccDNA, соответственно. Датчик TaqMan составлял 5’-FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMRA-3 ‘. Условия циклирования ПЦР состояли из начальной стадии денатурации при 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов амплификации 93 ° С в течение 15 с и 61 ° С в течение 1 мин.

Интрапептическую общую ДНК HBV и cccDNA детектировали с использованием того же метода, как описано выше. ДНК экстрагировали из 5 мг биопсии печени с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) и расщепляли с помощью плазмидной безопасной ДНКазы (Epicenter), как описано выше. Общая ДНК HBV была обнаружена с использованием того же коммерческого набора для ПКР реального времени TaqMan (Fosun Diagnostics). Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), один экземпляр домашнего хозяйства, представленный у людей, был обнаружен в том же образце и использовался для оценки количества клеток, представленных в каждой реакции ПЦР. Для амплификации GAPDH передние и обратные праймеры были соответственно 5′-CCAGGTGGTCTCCTCGACTT-3 ‘и 5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’. Датчик TaqMan составлял 5′-HEX-AACAGCGACACCCACTCCTCCACC-TAMRA-3 ‘. Серийные разведения геномной ДНК использовали в качестве стандартов для количественного определения ДНК GAPDH из биопсии печени. Производительность анализа для внутрипеченочной полной ДНК HBV была подтверждена изготовителем, а нижний предел обнаружения составлял 50 копий на 1 мг ткани печени (25 копий / 106 клеток). Нижний предел обнаружения внутрипеченочной HBV cccDNA составлял 30 копий на 1 мг ткани печени (15 копий / 106 клеток) в соответствии с последовательными исследованиями разведения HBV cccDNA, экстрагированными из тканей печени. Все результаты были преобразованы в копии / 106 ячеек в соответствии с уровнем GAPDH.

Статистический анализ проводился со Статистической программой социальных наук (SPSS 19.0 для Windows, SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Непрерывные переменные с искаженным распределением были протестированы с использованием теста Манна-Уитни. Корреляция между двумя переменными была проверена с использованием корреляционного анализа Спирмена после логарифмического преобразования данных. Статистическое значение было обозначено как значение Р менее 0,05.

Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и принципами хорошей клинической практики. Комитет по этике госпиталя № 6 Далянь одобрил это исследование. Все пациенты дали письменное информированное согласие. Два пациента были в возрасте от 16 до 18 лет и сами подписали документацию о согласии по письменному разрешению своих родителей, в котором родители указали, что они полностью поняли содержание информированного согласия и согласились на подпись своих детей. Таким образом, ни одно информированное письменное согласие не было получено от ближайших родственников, опекунов или опекунов от имени несовершеннолетних / детей, обучающихся в этом исследовании. Устное согласие не было принято. Комитет по этике госпиталя № 6 в Даляне согласился с этой процедурой.

Базовые характеристики пациентов до лечения приведены в таблице 1. Все пациенты имели китайскую этническую принадлежность, HBeAg положительный и ранее не получали противовирусные препараты.

ULN: верхний предел Normal.

Среди 120 пациентов, получавших терапию энтекавиром, 79 (65,8%) и 86 (71,2%) имели необнаружимую общую ДНК HBV и cccDNA, соответственно, в сыворотке. Существенное снижение общих уровней ДНК HBV с медианного уровня составляет 6,8 × 107 копий / мл (диапазон от 1,5 × 107 до 3,2 × 108 копий / мл) на исходном уровне до среднего уровня 2,5 × 103 копий / мл (диапазон , не определяемый до 2,2 × 106 копий / мл) на 48 неделе. Уровни cccDNA также уменьшались со среднего уровня 5,1 × 106 копий / мл (диапазон от 3,1 × 105 до 2,6 × 107 копий / мл) в начале исследования до медианы уровень 2,4 × 103 копий / мл (диапазон, неопределяемый до 6,7 × 104 копий / мл) на 48 неделе. Поскольку большинство пациентов продемонстрировали необнаружимую ДНК HBV сыворотки и cccDNA на 48 неделе, для расчета медианы были включены только пациенты с определяемыми результатами , Величины полной ДНК HBV и сокращения cccDNA были хорошо коррелированы (r
2 = 0,79, P 0,05].

Вирусологические и биохимические реакции 48-недельной терапии энтекавиром суммированы в таблице 2. Пациенты, принимающие энтекавир, показали значительное снижение уровней АЛТ с медиана уровня 136 U / L (диапазон 66-320 U / L) на исходном уровне до 48 U / L (диапазон 26-83 U / L) на 48 неделе. Значения CccDNA сыворотки HBV и снижение АЛТ не были достоверно коррелированы (r
2 = -0,022, P> 0,05). Однако величина редукции СККД сыворотки HBV у пациентов с нормализуемой ALT (

* Для расчета медианы были включены только определяемые образцы.

На 48 неделе сероконверсия HBeAg наблюдалась у 62 (51,7%) пациентов, получавших энтекавир. Пациенты, перенесшие сероконверсию HBeAg, имели значительно большее снижение среднего логарифмического общего HBV [4,36 (диапазон 2,01-6,39) против 2,51 (диапазон 1,32-3,96), P

Биопсии у 20 пациентов в начале исследования и на 48 неделе были доступны для внутрипеченочного общего анализа ДНК HBV и cccDNA. Все 20 пациентов продемонстрировали необнаружимую ДНК HBV и cccDNA в сыворотке на 48 неделе, но у всех была обнаруженная внутрипеченочная ДНК HBV и cccDNA. Тем не менее, уровни внутрипеченочной полной ДНК HBV и cccDNA значительно снижались после 48 недель лечения энтекавиром. На исходном уровне внутрипеченочная HBV cccDNA составляла небольшую часть общей нагрузки ДНК HBV, но на 48 неделе большая часть общей ДНК HBV состояла из cccDNA (таблица 3). Восемь (40%) пациентов показали сероконверсию HBeAg на 48 неделе.

Энтекавир эффективен в подавлении репликации HBV, индуцирует серологическое исследование HBeAg и снижает развитие цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Зазор HBeAg, индуцированный энтекавиром, прочен; однако клинический рецидив после прекращения терапии наблюдается и, вероятно, обусловлен остаточной внутрипеченочной cccDNA.

В этом исследовании мы исследовали влияние 48-недельной терапии энтекавиром на сывороточный и внутрипеченочный общий уровень ДНК HBV и cccDNA у пациентов с HBeAg-положительным гепатитом B. Наши результаты показали, что в течение 48 недель общий уровень HBV в сыворотке Уровни ДНК и cccDNA уменьшились примерно на четыре и три лога, соответственно. Снижение уровней сыворотки cccDNA примерно отражало аналогичную тенденцию в внутрипеченочном содержании cccDNA.

В настоящем исследовании мы также отметили, что у пациентов с сероконверсией HBeAg значительно большее снижение средних значений логарифмического уровня HBV и cccDNA, чем у тех, кто не подвергался сероконверсии HBeAg. Хотя величины снижений cccDNA и ALT не были достоверно коррелированы, снижение cccDNA в сыворотке у пациентов с нормализацией ALT было значительно больше, чем у пациентов с ALT-аномальным. Сыворотка HBV cccDNA может происходить от разрушения или лизиса гепатоцитов и подразумевает существование репликативных форм HBV в гепатоцитах. В настоящее время измерение ДНК HBV сыворотки является единственным способом мониторинга вирусологического ответа терапии в клинической практике. Этот метод, однако, не может отличить формы cccDNA и rcDNA HBV. Если обнаруживается, количественное измерение cccDNA сыворотки вместе с ДНК HBV может дать представление о профиле снижения как репликативных, так и нерепликативных форм вируса без необходимости повторной биопсии печени. Наши результаты, однако, также указывали на то, что даже когда сывороточная ДНК HBV и cccDNA были необнаружимыми, ХКВ-ккДНК оставалась в печеночных клетках. Таким образом, лечение энтекавиром в течение 48 недель не может искоренить HBV у пациентов с хронической инфекцией HBV. Последовательное измерение cccDNA в сыворотке крови обеспечивает только информацию о величинах редукции HBV cccDNA, что может оказаться полезным для понимания эффективности противовирусной терапии, но не может быть использовано для прогнозирования эрадикации HBV в печени.

HBV cccDNA обнаруживается в сыворотке пациента, HBV-инфицированных гепатоцитах и ​​внепеченочных инфицированных клетках, таких как лимфоциты периферической крови [13-15]. Вероятно, что cccDNA в сыворотке происходит из HBV-инфицированных гепатоцитов и внепеченочных клеток из-за лизиса инфицированных клеток, поскольку ранее сообщалось о выпуске нулевой нуклеиновой кислоты HBV в кровообращение [16-18]. Снижение сыворотки и внутрипеченочной cccDNA наблюдалось при антивирусной терапии ламивудином, адефовиром, энтекавиром и пег-интерфероном плюс адефовиром [9, 19, 20]. Исследования по моделям животных и клиническим исследованиям показывают, что показатели полной внутриклеточной ДНК HBV и потери cccDNA значительно различаются при антивирусной терапии [6]. Наши результаты показали, что величина снижения СККД сыворотки была ниже, чем у полной ДНК HBV, но не достигла статистической значимости. Вероятно, это результат иммунных механизмов, которые способствуют очищению или уничтожению инфицированных клеток [21, 22].

Скорость сероконверсии HBeAg была намного выше, чем сообщалось ранее. Точная причина этого несоответствия нуждается в дальнейшем изучении. Однако многие факторы способствуют сероконверсии HBeAg. В число этих факторов входят генотип HBV, мутация pre-C и мутации основного ядра, которые, в свою очередь, могут влиять на наблюдаемую скорость сероконверсии.

Хотя несколько антивирусных агентов доступны для лечения хронического гепатита В, энтекавир является одним из наиболее эффективных лекарств, рекомендованных Американской ассоциацией по изучению заболеваний печени и широко используется для лечения пациентов с хроническим гепатитом В [23]. У всех пациентов, перенесших вирусный рецидив после прекращения лечения, наблюдаются значительно более высокие уровни СККД, чем у пациентов, которые не рецидивы [24]. 1-летний курс лечения энтекавиром не может искоренить внутрипеченочную ксДНК HBV, и необходимо продолжить исследование влияния длительного лечения внутрикапельной ксДНК HBV.

В заключение, настоящее исследование продемонстрировало, что терапия энтекавиром может снижать уровни CccDNA в сыворотке крови на величину 3 log в пациентах с HBeAg-положительным хроническим гепатитом B. Кроме того, снижение уровня CccDNA в сыворотке было связано с сероконверсией HBeAg.



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий