Днк вич рнк вич

Днк вич рнк вич

Visualising single molecules of HIV-1 and miRNA nucleic acids
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3639109/

Недостаток некоторых видов нуклеиновых кислот и небольшой размер целевых последовательностей, таких как miRNA, налагают значительный барьер на субклеточную визуализацию и представляют собой серьезную проблему для клеточных биологов. Здесь мы предлагаем общий и высокочувствительный подход к визуализации (олиго-флуоресцентная гибридизация in situ, O-FISH), которая может быть использована для обнаружения таких нуклеиновых кислот с использованием одноолигонуклеотидного зонда длиной 19-26 нуклеотидов.

Мы использовали O-FISH для визуализации miR146a в клетках человека и птиц. Кроме того, мы выявляем чувствительность обнаружения O-FISH с использованием модельной системы ВИЧ-1, чтобы показать, что всего 1-2 копии нуклеиновых кислот могут быть обнаружены в одной клетке. Мы смогли различить недавно синтезированную вирусную кДНК и, кроме того, наблюдали, что определенные последовательности РНК ВИЧ только временно доступны для обнаружения O-FISH.

В совокупности эти результаты показывают, что метод O-FISH потенциально может быть использован для локального зондирования всего лишь 1-2 копий нуклеиновой кислоты и, кроме того, для визуализации небольшой РНК, такой как miRNA. Мы также предлагаем, чтобы метод O-FISH можно было расширить, чтобы понять вирусную функцию путем зондирования новых транскрибируемых вирусных промежуточных продуктов; и выявить локализацию интересующих нуклеиновых кислот. Кроме того, можно было бы опросить конформацию и структуру конкретной нуклеиновой кислоты in situ на основе доступности целевой последовательности.

Визуализация нуклеиновых кислот in situ может обеспечить значительную биологическую информацию на клеточном уровне. Обнаружение нуклеиновой кислоты в одной клетке обычно использует флуоресценцию in situ гибридизации (FISH). Традиционно FISH требует использования одиночных зондов с мелкими флуорофорами [1-6] или нескольких зондов, помеченных одним флуорофором [7-9], чтобы визуализировать (обзор см. В [10]). Недавние успехи в использовании усиления кругового круга от датчиков навесного замка [11] и разветвленных ДНК-зондов [12] значительно улучшили соотношение сигнал-шум, а также чувствительность во время обнаружения FISH. Однако требование относительно больших целевых последовательностей делает эти подходы непригодными для визуализации небольших РНК, таких как miRNAs. Альтернативные подходы включают в себя молекулярные маяки [13], MS2-GFP [14], квантовые точки [15] или субдифракционную микроскопию, однако, имеют присущие технические и измерительные ограничения, что делает их нецелесообразными для основного использования для ответа на биологические вопросы.

Чтобы улучшить ограничения обнаружения нуклеиновых кислот, мы модифицировали коммерчески доступный анализ лигирования близости (PLA) для обнаружения отдельных копий нуклеиновых кислот. PLA изначально предназначалась для обнаружения совместной локализации белков на расстоянии 40 нм [16]. Предполагаемое обнаружение ко-локализованных белков через PLA основано на использовании первичных антител к представляющим интерес белкам и двум видоспецифическим вторичным антителам, конъюгированным с короткими последовательностями ДНК, которые могут взаимодействовать с двумя короткими олигонуклеотидами ДНК с образованием циклизованной последовательности. Затем эту последовательность лигируют, амплифицируют путем полимеризации ДНК капиллярного круга, а амплифицированные последовательности гибридизуют с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами, что приводит к приблизительно двухсоткратному усилению исходного сигнала.

Здесь мы модифицировали технологию PLA для визуализации нуклеиновых кислот в фиксированных клетках. Способ включает в себя зондирующие целевые последовательности нуклеиновой кислоты с модифицированным протоколом FISH в сочетании с обнаружением связывания зонда с коммерчески доступным набором на основе PLA (мы назвали этот метод O-FISH). Первоначально целевые олигонуклеотиды, связанные с биотином, гибридизуются с представляющим интерес геном. Затем для связывания с меченым биотином зондом используется первичное антитело против биотина, и, наконец, PLA-метод обнаруживает сопряженный целевой комплекс для генерации сигнала O-FISH (рисунок 1). В этом исследовании мы использовали O-FISH для визуализации miR146a в клетках млекопитающих и птиц, демонстрируя свою способность обнаруживать miRNAs. Кроме того, мы использовали модель модели ВИЧ-1 для иллюстрации чувствительности обнаружения O-FISH, которая может достигать 1-2 копий нуклеиновых кислот в одной клетке. В этой модели мы смогли обнаружить как геномную РНК ВИЧ-1, так и вновь синтезированную вирусную кДНК, позволяющую визуализировать нуклеиновые кислоты на разных стадиях процесса обратной обратной транскрипции вируса. Неожиданно мы также заметили, что некоторые последовательности РНК ВИЧ являются только временно доступными для обнаружения O-FISH, подразумевая, что O-FISH потенциально может использоваться для локального зондирования временных структур нуклеиновой кислоты.

Обзор механизма O-FISH. Целевые нуклеиновые кислоты первоначально гибридизуются с биотинтилированным дополнительным олигонуклеотидным зондом (этап 1). Затем конъюгат биотина нацеливают на анти-биотиновое моноклональное антитело (mAb, этап 2). Проксимальный анализ лигирования (PLA), состоящий из + и — mAb, затем используют для нацеливания на специфический домен IgG связанного с биотином mAb (этап 3). Олигос, конъюгированный с каждым из mAb PLA, затем гибридизуют с образованием кольцевой ДНК (этап 4), а затем усиление кругового круга используется для эффективного умножения целевой последовательности (этап 5). Затем флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды гибридизуются с амплифицированной ДНК с круговым циклом, позволяя наблюдать мишень с помощью флуоресцентной микроскопии.

Для тестирования технологии O-FISH мы использовали вирусную систему ВИЧ-1, так как вирусный геном имеет четко определенный номер копии в каждом вирионе ВИЧ-1. Для ретровирусов, таких как ВИЧ-1, две идентичные копии генома РНК упаковываются в вирион [17], что делает отличные контрольные образцы, инфицированные ВИЧ-1, для оценки чувствительности и специфичности этой новой системы обнаружения нуклеиновой кислоты , Биотинилированный 26-нуклеотидный зонд, ориентированный на область ВИЧ-1 pol (Pol, см. Рисунок 2 для относительного положения генома), использовали для обнаружения присутствия геномов РНК ВИЧ-1 в инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клетках. Сигналы O-FISH были обнаружены в инфицированных ВИЧ-1 клетках (рис. 3b), на уровнях, четко различимых от минимальных фоновых сигналов, наблюдаемых в контроле над мафией (рис. 3a). Данные показывают, что обнаружение O-FISH Pol РНК является высокоспецифичным и способно отличать нуклеиновые кислоты ВИЧ-1 от клеточной РНК хозяина. Кроме того, мы показали, что флуоресцентно меченые вирионы ВИЧ-1 не коалицируются во время инфекции (рис. 3c-e), поэтому наблюдаемые сигналы O-FISH получены из независимых геномов вирусной РНК (рис. 3b). Эти данные показывают, что процедура O-FISH может обнаруживать всего лишь 2 копии нуклеиновой кислоты.

Определение последовательности зондов во время обратной транскрипции. Цветные полосы пространственно представляют последовательность нуклеиновой кислоты, обнаруженную каждым зондом O-FISH. Зон зонда (светло-зеленый) обнаруживает положительную чувствительную вирусную геномную РНК до ее деградации во время удлинения ДНК минус-цепи, а также обнаруживает синтез ДНК с поздней стадией плюс прямая (плюс удлинение ДНК линии). Зонд U5 / PBS (светло-голубой) обнаруживает положительный участок 5′-LTR чувствительности генома вирусной РНК, а также обнаруживает сильную стоп-ДНК (+ sss) с положительной цепью, которая возникает непосредственно перед переносом второй цепи. Сильный стоп-зонд (фиолетовый) обнаруживает сильную стоп-ДНК с отрицательной цепью, которая является первым сегментом ДНК, полученным во время обратной транскрипции, и поэтому обнаруживает всю кДНК от ранней обратной транскрипции. Зонд gag (темно-зеленый) обнаруживает всю кДНК из промежуточной точки в обратной транскрипции (после удлинения ДНК минус-тяны). Рисунок, адаптированный из Telesnitsky & Goff 29.

O-FISH-детектирование генома РНК ВИЧ-1. Для выявления нуклеиновой кислоты ВИЧ-1 клетки МТ-2 фиксировали через 6 часов после фиктивной инфекции (а) или заражения ВИЧ-1 (б) на стеклянные слайды и инкубировали с зондом O-FISH, нацеленным на ВИЧ-1 положительный смысл геномной РНК. Связанный зонд был обнаружен с использованием протокола O-FISH. Сигналы O-FISH показаны красным цветом, а ядра — синим. Изображения были получены из объемного сжатия z-стека из 16 изображений, полученных с шагом шага 0,4 мкм. Шкала шкалы, 10 мкм (a, b). Клетки МТ-2 были инфицированы смесью равных количеств HIVGFP-Vpr и HIVmCh-Vpr (контроль отрицательной колокации), фиксированный через 6 часов синхронной инфекции и визуализированный (c, d, e). HIVGFP-Vpr показан зеленым цветом (c, e), а HIVmCh-Vpr показан красным (d, e), и показано объединенное изображение HIVGFP-Vpr и HIVmCh-Vpr (e). Предоставленное изображение было получено из объемного сжатия z-стека из 25 изображений, сделанных с шагом шага 0,5 мкм. Шкала шкалы, 5 мкм (c, d и e). Ядра были помечены Hoechst 33258 (синий). Все микрофотографии представлены как минимум 5 изображений на каждое состояние.

Чтобы исследовать вирусные репликативные продукты кДНК в инфицированных ВИЧ-1 клетках, мы использовали два дополнительных биотинилированных 26-нуклеотидных зонда. Ранние вирусные кДНК-продукты были обнаружены с использованием зонда с отрицательным чувством, нацеленного на сильную концевую кДНК и продукты промежуточной вирусной кДНК с использованием зонда, нацеленного на кДНК кляпа (см. Рисунок 2 для относительного положения генома). Эксперименты с временным курсом показывают обнаружение возрастающих вирусных продуктов кДНК с течением времени с помощью количественной ПЦР (qPCR) (рис. 4). Когда O-FISH была нацелена на сильную остановку кДНК и кДНК кляпа в клетках MT2, было отмечено увеличение сигналов O-FISH через 4-6 часов после инфицирования по сравнению с контрольным образцом (рис. 5a, b). Сигналы O-FISH, обнаруженные с использованием зондов с сильным остановом и кляпом на протяжении всего времени инфекции, согласуются с наблюдениями сильной стоп-кДНК и кДНК кляпа, идентифицированной qPCR (рисунок 4), что указывает на то, что обнаружение сильной остановки кДНК и кДНК клыка Метод O-FISH отражает биологию цикла репликации ВИЧ-1. Кроме того, поскольку общепризнано, что из комплекса обратной транскрипции получают только одну копию вирусной кДНК, эти данные показывают, что наши зонды O-FISH могут обнаруживать всего лишь одну копию вирусной нуклеиновой кислоты, хотя это несколько осложняется фоновые уровни. Для обеспечения воспроизводимости этих наблюдений параллельная ВИЧ-1-инфекция проводилась с использованием альтернативной линии лимфоидных клеток, клеток Jurkat, что приводило к аналогичным сильным остановкам кДНК и сигналам кДНК O-FISH (рис. 5c, d). Эти данные также подтверждают надежность и воспроизводимость нашего метода O-FISH. Чтобы дополнительно подтвердить надежность метода O-FISH, мы разработали эксперименты для проверки специфичности протокола O-FISH. Из-за небольшого размера целевых последовательностей нуклеиновой кислоты, используемых для обнаружения, добавление ферментативной обработки РНКазы / ДНКазы для восстановления фона оказалось непрактичным из-за трудности в достижении полного переваривания нуклеиновой кислоты, необходимого для отмены обнаружения. В качестве альтернативы ингибитор обратной транскрипции AZT использовали для блокирования синтеза кДНК ВИЧ-1 и оценивали специфичность нашей сильной стоп-кДНК и сигнала кДНК O-FISH. Образцы обрабатывали AZT, затем анализировали через 12 часов после инфицирования, чтобы обеспечить максимальную репликацию ВИЧ-1 и, таким образом, сигналы O-FISH. Как и ожидалось, наблюдалось дозозависимое снижение зарегистрированной вирусной кДНК ВИЧ-1 в присутствии AZT (фиг. 6), что дополнительно демонстрирует специфичность метода сильной остановки кДНК и кДНК O-FISH.

Количественный анализ ПЦР (qPCR) вирусной репликативной кДНК во время ранней инфекции ВИЧ-1. Клетки МТ2 были либо фиктивными, либо инфицированными ВИЧ-1, а затем лизировали для анализа qPCR через 0, 2, 4 или 6 часов после инфицирования. Синтез кДНК ВИЧ-1 определяли с помощью qPCR с использованием праймеров для обнаружения ранних (сильных стоп) или промежуточных (кляп) продуктов обратной транскрипции. Копии кДНК ВИЧ-1 были нормализованы к номерам клеток с использованием ДНК CCR5.

O-FISH анализов вирусной репликативной кДНК во время ранней инфекции ВИЧ-1. Клетки MT-2 (a, b) и Jurkat (c, d) либо фиктивно инфицированы, либо инфицированы ВИЧ-1, а затем закреплены на стеклянных слайдах через 0, 2, 4 или 6 часов после инфицирования. Клетки инкубировали с помощью зондов O-FISH для обнаружения продуктов обратной транскрипции кДНК ВИЧ-1 (a, c) или промежуточного (gag) (b, d) HIV-1 (см. Рисунок 2 для относительной позиции генома). Связанные зонды были обнаружены с использованием метода O-FISH. Количественная оценка событий сигнала была выполнена с использованием функции пятен в Bitplane Imaris Software. Показанные данные представляют собой средние (+/- SEM) сигналы на ячейку, полученные из минимум 5 изображений на каждое условие. O-FISH были подсчитаны примерно в 120-150 ячейках в течение 24-36 полей для каждой из 4 панелей. Для определения уровня значимости наборов данных выполнялись парные двухсторонние t-тесты.

O-FISH анализов вирусной репликативной кДНК после блокировки ингибитором обратной транскриптазы AZT. Клетки МТ2 были инфицированы ВИЧ-1 в отсутствие или в присутствии АЗТ при концентрации 0,1 мкг / мл или 10 мкг / мл. Клетки фиксировали на стеклянных слайдах через 20 минут или через 12 ч после инфицирования и подвергали протоколу O-FISH с использованием зондов для обнаружения как сильной остановки кДНК, так и кДНК кляпа. Сигналы O-FISH сравнивали с соответствующими контрольными AZT-контролем через 12 часов после инфицирования. Изображения анализировались с использованием программного обеспечения Imaris. Показанные данные представляют собой средние (+/- SEM) сигналы на ячейку, полученные из минимум 5 изображений на каждое условие. Сигналы O-FISH подсчитывались в общей сложности 158 клеток (91 ячейка по 29 полям для зонда gag и 67 клеток по 29 полям для сильного зонда остановки).

Метод O-FISH также использовался для изучения структурных перестроек нуклеиновых кислот. Мы снова использовали HIV-1 в качестве модели, поскольку РНК ВИЧ-1 может подвергнуться структурным перестройкам на ранних стадиях цикла репликации [18-20] и, таким образом, может ограничить связывание зонда O-FISH с его мишенью из-за первоначального заполнения сайт связывания праймера с помощью тРНК и отсутствие вновь транскрибируемой вирусной кДНК. Более того, нет прямых доказательств, подтверждающих гипотезу о структурной перегруппировке из инфицированных ВИЧ-1 клеток [21], что побудило использовать ОФИС для изучения структурных конформационных изменений. Для исследования структурных конформаций ВИЧ-1 биотинилированный 24-нуклеотидный зонд был нацелен на область 5’UTR генома РНК ВИЧ-1 для оценки доступности последовательности ВИЧ-1 5 ‘U5 / праймер-связывающего сайта (PBS) во время ранняя фаза инфекции (U5 / PBS, Рисунок 2 для относительной позиции генома). Мы обнаружили, что 5′-R-PBS последовательность была временно доступной для нашего 5′-U5 / PBS O-FISH-детектирования через 2 часа после инфицирования с уменьшенными уровнями обнаружения через 0 и 4 часа после инфицирования, как показано в обоих MT2 ( Рисунок 7a) и Jurkat (рис. 7b) инфицированные ВИЧ-1 клетки. Хотя уменьшение 5′-U5 / PBS последовательностей между 2 и 4 часами после инфицирования является ожидаемым и может быть объяснено опосредованной РНКазой деградацией генома РНК ВИЧ-1, увеличение обнаруженных 5’-U5 / PBS последовательностей между 0 и 2 часовая пост-инфекция была неожиданным наблюдением.

O-FISH анализ конформационных перестроек РНК во время ранней инфекции ВИЧ-1. Клетки МТ2 (а) и клетки Юрката (б) были либо фиктивными, либо инфицированными ВИЧ-1, а затем прикреплялись к стеклянным слайдам через 0, 2 или 4 часа после инфицирования и инкубировали с зондом O-FISH ВИЧ-1 до детектируют РНК РНК U5 / PBS плюс прямую (см. рисунок 2 для относительной позиции генома). Изображения анализировались с использованием программного обеспечения Imaris. Показанные данные представляют собой средние (+/- SEM) сигналы на ячейку, полученные из минимум 5 изображений на каждое условие. Сигналы O-FISH подсчитывались в общей сложности 160 клеток (61 ячейка по 29 полям для клеток MT2 и 91 клетка в 20 полях для клеток Jurkat).

Поскольку геном РНК ВИЧ-1 не реплицируется в инфицированных клетках до более поздних временных точек, это увеличение не связано с увеличением числа геномов РНК в клетке. Вместо этого мы предполагаем, что увеличение обнаруженных сигналов обусловлено либо дифференциальным заполнением праймерной тРНК на PBS, либо структурными перестройками геномов вирусных РНК на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. РНК-перестройка, вероятно, будет критическим регулятором биологии ВИЧ-1 [22] и, следовательно, является областью многих исследований. Метод O-FISH имеет потенциал для предоставления возможности опросить конформационную перегруппировку РНК ВИЧ во время репликации или структурных перестроек РНК в целом и, таким образом, может предоставить вспомогательные данные для спекулированных структур РНК.

Чтобы проверить, может ли O-FISH обнаруживать небольшие РНК размером до miRNA, мы использовали 19-нуклеотидный O-FISH-зонд для определения уровней экспрессии miR146a как в куриных DF1, так и в человеческих клетках HeLa. Уровни MiR146a связаны с контролем интерферона 1-го типа [23] и изменяются при стимуляции во время вирусной инфекции [24] или вирусных мимиках, таких как dsRNA polyinosinic: polycytidylic (pIC) [23]. При лечении ПИК значимые дифференциальные картины распределения miR146a наблюдались как в клетках DF1 (рис. 8c, d), так и HeLa (рис. 8g, h). Контрастные изменения в уровнях miR146a, индуцированные pIC-обработкой в ​​тестируемых типах клеток (пониженные в DF1 [рис. 8d] и повышенные уровни в HeLa [рис. 8h]) согласуются с qRT-PCR-анализом (рис. 8a, e) , Минимальный фоновый сигнал был обнаружен, когда биотинилированный miR146a-зонд не использовался в реакции O-FISH (рис. 8b, f), иллюстрирующий O-FISH, можно использовать для обнаружения небольших последовательностей РНК длиной ~ 20 нуклеотидов, таких как miR146a.

O-FISH обнаружение miR146a. DF1 куриные фибробласты и клетки HeLa либо трансфицировали (b, c, f, g), либо трансфицировали pIC (DF1: 10 мкг / мл [d], HeLa: 5 мкг / мл [h]) в течение 3 часов, а затем анализировали с помощью qRT-PCR. Данные qRT-PCR показаны для клеток DF1 (a) и HeLa (e). Процедура обнаружения O-FISH (без зонда O-FISH miR146) проводилась как отрицательный контроль (DF1 [b], HeLa [f]). Показаны сигналы O-FISH после ложной трансфекции в клетках DF1 (c) и HeLa (g) и pIC-обработка клеток DF1 (10 мкг / мл) (d) и HeLa (5 мкг / мл) ( h). Связанный зонд был обнаружен с использованием метода O-FISH. Микрофотографии представлены как минимум 5 изображений на каждое состояние. Ядра были помечены Hoechst 33258. Сигналы O-FISH показаны красным цветом, а ядра — синим. Предоставленные изображения были получены из объемного сжатия z-стека из 16 изображений, полученных с шагом шага 0,4 мкм. Шкала шкалы 25 мкм применяется к ячейкам DF1 и HeLa (b-d, f-h).

Данные, приведенные здесь, не только обеспечивают доказательство концепции протокола O-FISH, но также демонстрируют специфическое обнаружение как генома РНК с положительным смыслом ВИЧ-1, заражающего вирионы, так и вирусной кДНК, полученной из обратной транскрипции в естественных клетках-мишенях ВИЧ- 1. Использование очень коротких олиго-зондов в сочетании с новым методом амплификации сигнала обеспечивает гибкость для использования этого метода для обнаружения очень коротких последовательностей цепей нуклеиновой кислоты в клетках. Здесь мы установили, что это позволяет как обнаружение специфических продуктов кДНК, которые часто бывают короткими и скудными по своей природе, во время процесса обратной транскрипции ВИЧ-1 и нативных клеточных миРНК. Кроме того, мы наблюдали данные, которые предполагают, что этот метод также может быть применен к зондирующей структуре РНК и событиям связывания. Этот метод может быть расширен до обнаружения вирусных нуклеиновых кислот в дополнительных вирусных моделях, что является важным инструментом для биологических исследований для создания сложных вирусных транскрипционных процессов. Кроме того, способность этого метода обнаруживать короткие клеточные последовательности нуклеиновой кислоты, такие как miRNAs, показывает, что O-FISH может быть легко адаптирована для использования вне области вирусологии и может оказаться полезным инструментом для изучения более общих процессов в клеточной биологии.

Таким образом, наши данные показывают, что O-FISH может обнаруживать низкие копии нуклеиновых кислот, длина которых составляет всего лишь 20 нуклеотидов. Кроме того, O-FISH предлагает новый метод идентификации субклеточного распределения нуклеиновых кислот и miRNAs во время биологических процессов. Кроме того, используя преимущества новых синтезированных вирусных нуклеиновых кислот, которые являются уникальными для инфекционных вирусных частиц, O-FISH также может использоваться для выявления и отслеживания низкого процента функциональных вирусов во время инфекции. Более того, O-FISH может предоставлять данные для поддержки гипотетических структурных перестроек РНК, как мы наблюдали в контексте ВИЧ-1.

293T поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Eagle / высокомодифицированной (с 4500 мг / л декстрозой и 4 мМ L-глутаминовой) средой (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), дополненной тепловой инактивированной 10% (об. / Об.) (CCS; Hyclone, Tauranga, New Zealand) и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина (P / S) (Invitrogen). Клетки MT-2 и Jurkat (полученные в рамках Программы исследований СПИДа и справочной реактивов, Отдел СПИДа, NIAID, NIH) культивировали в среде 1650 среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Invitrogen), дополненной инактивированной энергией 10% об. / Об. фетальной телячьей сыворотки (FCS, Invitrogen) и P / S. В DMEM поддерживали 10 мкл FCS, 2 мМ глутамина, 1,5% бикарбоната натрия и P / S, а также клетки HeLa (American Type Culture Collection [ATCC], CCL-2) и клеточную линию фибробластов курицы DF1 (ATCC, CRL-12203) ,

Запасы вируса ВИЧ были получены поли (этиленимином) (PEI, Polysciences Inc., Уоррингтон, Пенсильвания, США), совместное трансфекцирование клеток 293T с полной длиной плазмидной ДНК pNL4.3 ВИЧ-1 (полученной через Национальные институты здоровья СПИДа Reagents Program от Dr. Malcolm Martin [25]) и либо гибридный белок EGFP-Vpr, экспрессирующий плазмиду pEGFP-Vpr, либо гибридный белок mCherry-Vpr, экспрессирующий плазмиду mCherry-Vpr (добрый подарок от профессора Тома Хоупа, Северо-западного университета, Чикаго ) для продуцирования HIVGFP-Vpr и HIVmCh-Vpr. Клетки подсчитывали и помещали в 1 × 106 клеток на планшет на планшеты для тканевой культуры 10 см в 6 мл среды. Через двадцать четыре часа клетки трансфицировали 2,5 мкг плазмидной ДНК (1,875 мкг pNL4,3 и 0,625 мкг pEGFP-Vpr) при соотношении PEI: ДНК 9: 1. Двенадцать часов после трансфекции клеток дважды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (без кальция и магния, PBS-) и свежими средами. Супернатанты собирали через 36 часов после трансфекции, а клеточный мусор удаляли путем последовательной фильтрации через 0,8 мкм и 0,45 мкм стерильные шприцевые фильтры (Sartorius, Goettingen, Germany). Затем частицы вируса концентрировали ультрацентрифугированием через 20% сахарозную подушку, используя ультрацентрифугу L-90 (ротор SW-41, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) при 100000 × g в течение 1 часа при 4 ° C. Затем гранулы ресуспендировали в бензоназном буфере [20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 2 мМ MgCl2, 20 мМ NaCl] и обрабатывали 90 единиц / мл бензоназы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) в течение 30 мин при 37 ° C для удаления любой загрязняющей плазмидной ДНК. Концентрированные вирусные запасы количественно определяли с использованием анализа вируса Vironostika HIV-1 (p24 CA) MicroELISA (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Франция) в соответствии с инструкциями производителя и замораживали в одноразовых аликвотах при -80 ° C.

Синхронные инфекции выполнялись, как описано ранее [26]. Клетки MT-2 или Jurkat были спинолитированы 300 нг p24 CA, как определено вирусом Vironostika HIV-1 (p24 CA) MicroELISA (биомером, Marcy l’Etoile, France) вирусом на 1 × 106 клеток в течение 2 ч при 1200 × г в 12 или 24 луночных планшетах с температурой непереносимости (15 ° С). После спинокуляции клетки дважды промывали PBS- для удаления несвязанного вируса и инкубировали в теплых средах при 37 ° C, 5% CO2 для инициирования инфекции.

В рамках эксперимента с использованием ингибитора RT-ингибирования AZT-проназы использовали 20 минут после заражения, чтобы удалить все белки из-за пределов клеток, тем самым удалив любые связанные, но не введенные вирионы с поверхности клетки. Двадцать минут после спинуоцитирующих клеток промывали и ресуспендировали в охлажденном льдом растворе соляной соли Хэнка (HBSS, Invitrogen), содержащем 2 мг / мл протеазы из Streptomyces griseus (проназа E; Sigma-Aldrich) в течение 10 мин на льду. Затем клетки интенсивно промывали HBSS, содержащим 10% FCS, затем добавляли свежие среды и клетки инкубировали при 37 ° C.

Ингибитор RT Zidovudine (AZT) был получен через программу исследований СПИДа и справочного реагента, отделение СПИДа, NIAID, NIH. AZT добавляли к супернатантам клеточной культуры в точке заражения при 0,1 или 10 мкг / мл в виде отдельных условий. АЗТ поддерживали в супернатанте клеточной культуры на протяжении всей инфекции.

Введение синтетических нуклеиновых кислот в клетки DF1 или HeLa проводили с использованием трансфекционного реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, полиинозино-полицитидиловую кислоту (pIC) разбавляли до 10 раз до конечной концентрации в средах, а липофектамин разбавляли в среду при 1 мкл / см2 площади ямы. Через 5 мин Липофектамин и ПИК объединяли 1: 1, инкубировали в течение 15 мин и затем добавляли к клеточной культуре согласно инструкциям производителя (Invitrogen).

Количественную оценку продуктов обратной транскрипции ВИЧ-1 и стандартизацию числа клеток проводили с использованием количественной ПЦР (qPCR). Клетки собирали в различные моменты времени после инфицирования и лизировали в буфере для лизиса ПЦР, содержащем 10 мМ Трис [рН 8,0], 50 мМ KCl с 0,5 об.% Об. Тритон-X100, 0,5% об. / Об. NP-40 и 75 мг / мл протеиназы K (Roche, Basel, Switzerland). Образцы инкубировали при 56 ° С в течение 2 ч до того, как протеиназу К инактивировали нагреванием до 95 ° С в течение 10 мин. Затем образцы хранили при -20 ° С. Количественную ПЦР проводили на машине MX3000P QPCR (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Каждая реакция ПЦР содержала 1 × Brilliant II SYBR Green Master mix (Agilent), 400 нМ каждого праймера и 5 мкл клеточных лизатов (разведение 1:10) в 15 мкл реакционном объеме. Специфические для ВИЧ-1 праймеры M667 (смысл, 5′-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-3 ‘) и AA55 (антисмысловые, 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTGAC-3′) были использованы для обнаружения ранней кДНК ВИЧ-1 ([-] сильной остановки ДНК). Специфические для ВИЧ-1 праймеры M667 (смысл, 5’-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-3 ‘) и M661 (антисмысловые 5′-CCTGCGTCGAGAGATCTCCTCTGG-3′) использовали для обнаружения промежуточных продуктов обратной транскрипции ВИЧ-1 (LTR / gag, post 2nd strand перевод). Условия ПЦР ВИЧ-1 были начальной денатурацией при 95 ° С в течение 15 мин с последующим 40 циклами циклирования при 95 ° С в течение 10 с, затем 60 ° С в течение 30 с. Номера клеток были стандартизированы для человеческого CCR5-гена с использованием праймеров LK46 (смысл: 5’-GCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGA-3 ‘) и LK47 (антисмысловой, 5′-CTCACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC-3’). Условия ПЦР CCR5 были исходной денатурацией при 95 ° С в течение 15 мин с последующим 40 циклами циклирования при 95 ° С в течение 20 с, 58 ° С в течение 40 с и 72 ° С в течение 40 с.

РНК собирали с использованием Tri-реагента (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Один мкг экстрагированной РНК подвергали обработке ДНКазой с использованием набора DNase 1 (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Обработанную ДНКазой РНК затем полиаденилировали 300 единицами полиаденилазной полимеразы до конечного объема 20 мкл и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин, затем 95 ° С в течение 5 мин, аналогично методу Ши и др. [27]. MiRNA транскрибировали с обратной транскрипцией до комплементарной ДНК (кДНК) с использованием набора для синтеза первой цепи Superscript III (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя, затем разбавляли до 1:20. qRT-PCR проводили с использованием Sybr Green (прикладные биосистемы) и метода сравнительного порогового цикла для получения изменения смены, ранее описанного Bannister и др. (2011). Первую праймерную последовательность miR146 (5’GCG TGA GAA CTG AAT TCC ATG GG) и эндогенный контрольный miR5.8S (5 ‘TGG GAA TAC CGG GTG CTG T) индивидуально амплифицировали с помощью универсального обратного праймера (5’ GAG GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C) для получения значений Ct для анализов, подобных Bannister et al. [28].

Клетки фиксировали либо 4% формальдегидом в PBS — при 4 ° C в течение ночи (анализы на ВИЧ), либо в 300 мкл метанола в течение 20 минут при 20 ° C (miR146 анализы), а затем дважды промывали в PBS. Фиксированные клетки устанавливали на слайды с использованием машины Cytospin II (Shandon, Astmoore, UK) при 67 × g в течение 5 минут. Слайды удаляли и сушили на воздухе в течение ночи в темноте. Слайды либо сразу обрабатывались, либо хранили в герметичных мешках при -20 ° C до тех пор, пока они не понадобятся. Все реакции проводили в виде реакций с открытыми каплями с объемом капель 15 мкл. Клетки регидратировали в PBS в течение 5 минут и пермеабилизировали 0,2% Тритоном в течение 6 минут, затем дважды промывали PBS- перед обработкой 0,005% пепсином (Sigma-Aldrich) в 0,01 н. HCl в течение 1 мин (лечение пепсином было опущено в анализ miR146), а затем снова дважды промывали PBS. Затем образцы зонда O-FISH разбавляли до конечной концентрации 500 нМ в буфере для гибридизации (10 мМ TRIS [рН 7,4], 600 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10 нМ DTT, 0,1% SDS, 50% формамида) и добавляли к клеткам, которые инкубировали во влажной камере при 37 ° С в течение 1 часа. Клетки дважды промывали PBS и блокировали в блокирующем буфере (Olink Bioscience, Uppsala, Sweden) при 37 ° C в течение 30 минут. Связывание зонда обнаруживали путем инкубации с антибиотином первичного антитела (Sigma-Aldrich), разведенного 1: 500 для нуклеиновых кислот ВИЧ-1 или 1: 1500 для miR146 в разбавителе антител (Olink Bioscience) во влажной камере при комнатной температуре для 30 минут. Обнаружение связывания первичного антитела проводили с использованием PLA-зондов Duolink II и набора для обнаружения (биологическая наука Олинка) в соответствии с инструкциями производителя. После обнаружения O-FISH клетки были контрастированы с Hoechst 33258 (Invitrogen), а затем смонтированы в Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) или смоделированы непосредственно с использованием флуормата с DAPI (Olink Bioscience) для микроРНК-микроскопии.

Зонды были разработаны в дополнение к различным частям генома РНК ВИЧ-1, к кДНК ВИЧ-1, синтезированной на разных стадиях процесса обратной транскрипции, или к miR146. Для обнаружения положительной чувствительности РНК ВИЧ-1 использовали отрицательные зонды pol (5 ‘CTG TCA GTT ACA TAT CCT GCT TTT CC 3’) и U5 / PBS (5 ‘CGG GCG CCA CTG CTA GAG ATT TTC 3’). Потенциальные зонды зонда (5 ‘ATG GGT GCG AGA GCG TCG GTA TTA AG 3’) и сильный останов (5 ‘TGT GAC TCT GGT AAC TAG AGA TCC CT 3’) были использованы для определения отрицательной чувствительности кДНК ВИЧ-1. Зонд miRNA (5 ‘CCC ATG GAA TTC AGT TCT C) использовался для обнаружения miR146a. У всех зондов была молекула биотина, конъюгированная с их 5’-концом.

Для анализа HIV O-FISH изображения были получены с использованием микроскопа DeltaVision-RT (Applied Precision, Issaquah, WA, USA) или Zeiss Axio Observer Z1 (Zeiss). Изображения, сделанные на DeltaVision-RT, были получены в серии z на камере с зарядовой связью (CCD) (CoolSnap HQ; Photometrics, Tucson, AZ, USA) с помощью либо числовой апертуры (NA) 60X 1.42, либо 100X 1,4 NA масляная иммерсионная линза. Также были получены справочные яркие изображения. Перед анализом изображения деконструировали с помощью программного обеспечения для деконволюции softWoRx (Applied Precision). Все изображения, сделанные на Zeiss Axio Observer Z1, были взяты в z-серии на камере с зарядовой связью (CCD) (AxioCam MRm Rev. 3, Carl Zeiss, Германия) через 100X 1,30 масляную иммерсионную линзу. Также были получены сравнительные дифференциальные контрастные изображения (DIC). Изображения минимум 5 полей были взяты за слайд для анализа для всех экспериментов. Изображения клеток анализировали путем количественного определения флуоресцентного сигнала с использованием программного обеспечения Bitplane Imaris (Bitplane AG, Цюрих, Швейцария). Для анализа miRNA использовались аналогичные процедуры, но образцы были отображены с использованием конфокального микроскопа Leica (Leica Microsystems, Sydney) SP5. Были собраны изображения флуоресценции и DIC, и все изображения были сделаны с теми же параметрами микроскопа. Количественная оценка сигналов сигнала O-FISH выполнялась с использованием функции пятен в Imaris (Bitplane AG, Швейцария). Сигналы O-FISH обозначались как минимум 0,5 мкм в диаметре, и интенсивность определялась на экспериментальной основе для каждого набора слайдов. Общее количество сигналов O-FISH делилось на количество ядер для каждого изображения. Среднее значение для каждого образца затем вычислялось из среднего значения между 13,4 и 30 ячейками в момент времени и состояло, по меньшей мере, из пяти случайно полученных изображений (в результате чего данные составляли от 120 до 160 ячеек на каждую панель на каждой фигуре) и сообщается как «сигналы на ячейку».

Статистический анализ выполнялся с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Для сравнения различий между двумя наборами наблюдений использовались парные двухсторонние t-тесты.

KLJ, AK, BH, AL и PM провели эксперименты; Эксперименты KLJ, MJ, MT, AH и JM; KJ, MT, CFP, AL, PM и AH предоставили критические реагенты и инструменты; KLJ, AK, BH и JM писали рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Эта работа была поддержана грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии и Австралийского исследовательского совета. Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись. Авторы признают поддержку AMMRF в ABMF.



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий