Штаммы вируса гепатита а

Штаммы вируса гепатита а

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

Genetic Relatedness among Hepatitis A Virus Strains Associated with Food-Borne Outbreaks
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3819349/

Конкурирующие интересы: авторы хотели бы заявить, что д-р Юрий Худяков является академическим редактором PLOS ONE; однако это не меняет приверженности авторов ко всем политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: Г. В. Еек. Выполняли эксперименты: GV JCF LMGR. Проанализированы данные: GV GX MAP PRS. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: GV YEK. Написал газету: Г. В. Еек.

Генетическая характеристика штаммов вируса гепатита A (HAV) обычно выполняется путем секвенирования субгеномных областей, таких как соединение VP1 / P2B. HAV-геном не является сильно изменчивым, что дает возможность для обмена последовательностями субгеномных областей между генетически несвязанными изолятами. Степень искажения филогенетических отношений субгеномными регионами особенно важна для отслеживания передач. Здесь мы проанализировали последовательности цельного генома (WG) из 101 штамма HAV, идентифицированные из 4 основных многогосударственных, пищевых вирусов гепатита A в Соединенных Штатах и ​​из 14 штаммов HAV, не связанных с вспышкой, которые разделяют идентичные VP1 / P2B последовательности с штаммами вспышки. Хотя штаммы HAV с идентичной последовательностью VP1 / P2B были специфичны для каждой вспышки, WG были разными, а генетическое разнообразие достигало 0,31% (в среднем 0,09%). Оценка различных субгеномных регионов не идентифицировала какой-либо другой раздел генома HAV, который мог бы точно представлять филогенетические связи, наблюдаемые с использованием последовательностей WG. Идентификация 2-3 доминирующих штаммов HAV в 3 из 4 вспышек указывает на загрязнение причастных пищевых продуктов гетерогенной популяцией HAV. Тем не менее, анализ вариантов внутриполостного HAV у восьми пациентов, участвующих в одной вспышке, показал, что только у одного варианта последовательности была установлена ​​инфекция у каждого пациента. Было обнаружено, что четыре штамма вне вспышки были тесно связаны с штаммами из 2 вспышек, тогда как десять были генетически отличны от штаммов вспышки. Таким образом, точное отслеживание HAV-штаммов может быть выполнено с использованием последовательностей HAV WG, в то время как короткие субгеномные области полезны для идентификации передач только среди случаев с известной эпидемиологической ассоциацией.

Вирус гепатита А (HAV), возбудитель гепатита А, отвечает за приблизительно 1,5 миллиона зарегистрированных случаев и десятки миллионов инфекций каждый год, что составляет самый высокий вирусный гепатит во всем мире [1]. Хотя гепатит А является самоограниченным заболеванием печени [2], он иногда прогрессирует до тяжелой, опасной для жизни болезни [3], [4].

HAV представляет собой одноцепочечный, положительный РНК-вирус, принадлежащий к семейству Picornaviridae
[2]. Геном HAV составляет приблизительно 7500 нуклеотидов (nts) в длину, состоящий из 5′-нетранслируемой области (UTR) ~ 740 нц, кодирующей области ~ 6881 нс и 3 ‘UTR 40-80 нц [5]. Кодирующая область кодирует большой полипротеин, который был разделен на сегменты P1, P2 и P3. P1 обрабатывают тремя основными белками вирусного капсида, VP1, VP2 и VP3 и VP4, который играет роль в сборке вирионов [5]. Неструктурные белки образуются при расщеплении протеазы P2 и P3 [5]. Геном гетерогенен, позволяя классифицировать HAV на шесть генотипов и несколько субгенотипов [6], [7], [8], [9]. Неоднородность оказывает ограниченное влияние на антигенное разнообразие и приводит к существованию одного серотипа [10]. HAV генотипы и подтипы неравномерно распределены по всему миру. Подтипы IA и IB распространены в Северной и Южной Америке, Европе, Китае, Японии и Таиланде [11]. Большинство штаммов человеческого негенотипа I относятся к субгенотипу IIIA и циркулируют в Индии, Казахстане, Европе и США [12], [13]. Наиболее распространенным субгенотипом в Соединенных Штатах является IA, за которым следуют субгенотипы IB и IIIA [8], [12].

Распространенность инфекции HAV варьируется в разных регионах мира [12]. В странах с низкой распространенностью вспышки гепатита А оказывают значительное влияние на общественное здравоохранение [14]. В Соединенных Штатах сообщалось о крупных многострановых вспышках гепатита А, связанных с зараженной пищей [15], [16], [17]. В 2003 году в Теннесси, штат Северная Каролина, Джорджия и Пенсильвания было зарегистрировано 1023 случая гепатита А, связанных с потреблением зеленого лука [16], [17]. В 2005 году 39 случаев гепатита А были зарегистрированы в штатах Алабама, Флорида, Южная Каролина и Теннесси среди людей, которые потребляли устрицы [15]. Молекулярный анализ области VP1 / P2B показал, что последовательности штаммов HAV, связанных с загрязненным луком, можно разделить на 3 разные генетические группы, а последовательности HAV, связанные с потреблением устриц, принадлежали к другой генетической группе. Все четыре группы принадлежали к субгенотипу IA. Каждая группа имела идентичные последовательности VP1 / P2B [16], [17], [18].

Генетическое разнообразие HAV обычно оценивается с использованием различных субгеномных областей [7], [9], [19]. Хотя последовательности соединения VP1 / P2B наиболее часто используются для идентификации генотипов, отслеживания передачи и оценки филогенетических отношений между штаммами HAV [8], [15], [16], [17], мало известно о том, насколько точно этот регион или другие субгеномные области представляют генетическую гетерогенность ГАВ.

Этот молекулярный анализ детализирует генетическую гетерогенность среди вариантов HAV, идентифицированных во время вышеупомянутых многогосударственных, пищевых вспышек.

Образцы сыворотки (n = 101) из четырех крупных пищевых вспышек [15], [16], [17] были случайным образом отобраны для секвенирования WG. Образцы были собраны из: трех вспышек в 2003 году, связанных с потреблением зеленого лука в Теннесси (вспышка A, n = 18), Пенсильвания, Огайо и Западная Вирджиния (вспышка B, n = 34), Северная Каролина и Грузия (вспышка C; n = 25) [16], [17] и многоуровневая вспышка в 2005 году, связанная с потреблением устриц (вспышка D; n = 24) [18]. Был получен дополнительный набор образцов (n = 14), полученный из спорадических (то есть, не наружных) штаммов, разделяющих последовательности VP1 / P2B с штаммами от вспышек A, B и D. Образцы были собраны в период между 1998 и 2008 годами из надзора Стражей в Странах над острого вирусного гепатита и пограничных инфекционных заболеваний (8).

Последовательности WG были получены из 16 перекрывающихся фрагментов ДНК, амплифицированных с использованием вложенного лабораторного протокола ПЦР. Вкратце, общая РНК была извлечена из образцов сыворотки с использованием автоматизированной системы MagNA Pure LC (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) и комплекта полной нуклеиновой кислоты (Roche). Затем экстрагированный материал подвергали обратной транскриптазе (RT) -PCR с использованием одностадийного набора RT-PCR (QIAGEN, Valencia, CA), чтобы получить 16 ампликонов, охватывающих всю длину генома HAV. Ампликоны затем использовали в качестве шаблонов для ПЦР второго раунда с использованием набора SYBR Green Perfecta (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD). ПЦР-праймеры показаны в таблице 1. ПЦР-амплификацию проводили на LightCycler 480 (Roche). Анализ кривой плавления проводили для идентификации ПЦР-положительных образцов. Обе линии ДНК были секвенированы с использованием автоматизированного генетического анализатора 3100 (Applied BioSystems, Foster City, CA). Последовательности WG, описанные в этой работе, были депонированы в GenBank.

Электрофореграммы были проанализированы, и последовательности contigs были построены и отредактированы для реконструкции WG HAV с использованием SeqMan v8.1, Lasergene Package (DNAstar Inc., Madison, WI). Алгоритм Kalign (http://www.ebi.ac.uk/Tools/kalign) использовался для создания выравниваний и анализа последовательностей. Ориентация была проверена и оптимизирована вручную. Филогенетический и молекулярный эволюционный анализ проводили с использованием MEGA версии 4 [20] и пакета анализа последовательности Висконсина (Genetic Computer, Madison, WI), как описано в другом месте [16]. Медийные соединительные сети (MJN) были построены с использованием DNA Alignment (http://www.fluxus-technology.com/) и сетевого программного обеспечения v4.5.1.6 [21].

Среднее число различий nt на сайт между двумя последовательностями, разнесение nt (π), было рассчитано с использованием DnaSP v5.1 [22]. Метод раздвижного окна с окнами 500 нц и шагом 25 нс использовался для расчета π по всему выравниванию для каждой независимой вспышки. Значения для каждого окна были рассчитаны и назначены на позицию nt в середине каждого перекрывающегося окна.

Независимые выравнивания для каждой вспышки были сканированы с использованием окон размером 500 нт и шагом 25 нс. Таким образом, было создано 1370 различных независимых выравниваний, охватывающих полноразмерный вирусный геном для каждой вспышки. Генетические расстояния (параметр Кимура 2) были рассчитаны с использованием DNAdist, как реализовано в Phylip v3.5. Впоследствии соответствующие филогенетические деревья соседей соединялись для каждой матрицы, как описано в другом месте [23]. Полученные деревья сравнивались с деревом WG с использованием метода симметричной дистанции, реализованного в программе Treedist. Расстояния между деревьями были построены по сравнению с nt положениями по всему геному.

Генетическая вариабельность HAV-хозяина была оценена с использованием модифицированной версии ПЦР в режиме реального времени (EPLD) в режиме реального времени (EPLD) [24], [25]. Вкратце, очищенную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК и серийно разбавляли в четыре раза (0,25 log-разведения). Все разведения усиливали в течение двух раундов ПЦР в реальном времени. Конечным пунктом считалось разведение, обеспечивающее 50% положительность. В этих условиях примерно 50% реакций не переносят шаблонные молекулы и не генерируют амплификацию ПЦР. Таким образом, генерируемые ампликоны, скорее всего, происходят из одного шаблона. Были секвенированы множественные клоны ПЦР (30-40 на образец) на одного пациента.

Эпидемиологические данные, полученные с помощью расширенного эпиднадзора за вирусными гепатитами для 14 спорадических изолятов, были проверены, чтобы выяснить, были ли ранее непризнанные связи с четырьмя вспышками. Данные о случаях для спорадических и очаговых штаммов были сопоставлены в отношении даты появления симптомов, географического положения, факторов риска или воздействия.

Шестнадцать перекрывающихся фрагментов ПЦР, охватывающих всю длину генома HAV, последовательно амплифицировали из всех HAV-ПЦР-положительных образцов, что указывает на равномерную чувствительность всех наборов праймеров ПЦР. Используя этот протокол, были получены 101 последовательности WG. Филогенетический анализ поддерживал кластеризацию изолятов HAV на четыре группы внутри подтипа IA (рис. 1A). В отличие от последовательностей VP1 / P2B, которые были идентичны в каждой группе, последовательности WG были гетерогенными (таблица 2). Последовательности WG были менее разнообразными (среднее генетическое расстояние 0,21, диапазон 0,14-0,27) в группах A, B и C, чем в группе D (среднее генетическое расстояние 1,94, диапазон 1,92-2,03).

Филогенетический анализ с использованием последовательностей (a) WG, (b) VP1 / P2B, (c) 5′-UTR, (d) N-конец гена VP1 и (e) весь VP1.

В группе A были идентифицированы девять уникальных последовательностей WG, причем одна последовательность разделялась 15 изолятами, а остальные восемь последовательностей распределялись среди 10 HAV-изолятов (рисунок 2). В группе B одна последовательность разделялась восемью изолятами, другая — шестью изолятами и 20 изолятами делили 18 различных последовательностей. В группе C основную последовательность разделяли четыре изолята, а вторая основная последовательность — на три изолята и еще одну последовательность на два изолята; остальные восемь различных последовательностей были представлены одиночными изолятами. В группе D две основные последовательности были разделены на восемь и три изолята соответственно, а остальные 13 различных последовательностей принадлежали одиночным изолятам (рисунок 2).

Медианы Объединения сетей, построенные с использованием последовательностей WG. Вирусные штаммы от каждой вспышки кодируются цветом. Основные варианты HAV обозначаются символом «*».

Поиск нескольких штаммов HAV, отличающихся друг от друга на сайтах с 6-23 нт в опухолях, связанных с луком или устрицами, указывает на то, что пищевые продукты, вероятно, были заражены более чем одним штаммом HAV, а не одиночными штаммами, развивающимися у инфицированных пациентов, для получения наблюдаемых генетических гетерогенность, наблюдаемая при каждой вспышке. Таким образом, каждый инфицированный пациент, вероятно, подвергался множественным вирусным вариантам, что приводило к созданию разнообразной вирусной популяции внутри хозяина. Чтобы исследовать, был ли каждый пациент заражен гетерогенной вирусной популяцией, клональный анализ вариантов HAV проводился с использованием EPLD. Сканирование выравнивания последовательностей HAV с использованием скользящего окна показало, что наиболее вариабельная область среди штаммов группы B находилась в области P3 в положениях nt 6000-7250 (рис. 3). Эта область была использована для генерации 30-40 клональных последовательностей для каждого пациента. Все последовательности у каждого из восьми пациентов, испытанных EPLD, были идентичными, что свидетельствует о том, что, несмотря на воздействие нескольких вирусных вариантов, каждый испытуемый пациент заразился одним вариантом HAV. Другая возможность заключается в том, что каждый пациент был заражен несколькими вариантами HAV, но только один стал доминирующим.

График был построен с использованием скользящего окна 500 нт и шагом 250 нт.

Последовательности WG были получены из 14 штаммов HAV, идентифицированных в рамках наблюдений за Страническими Странами над острого вирусного гепатита и исследований пограничного инфекционного заболевания, которые разделяли идентичные последовательности VP1 / P2B с штаммами, выявленными в четырех вспышках. Было обнаружено, что пять штаммов разделяют последовательность VP1 / P2B с группой A, восемь с группой B и группу с группой D. Никакие изоляты, разделяющие одну и ту же последовательность VP1 / P2B со вспышкой C, были доступны. Анализ MJN был использован для визуализации генетической зависимости среди изолятов HAV, разделяющих последовательности VP1 / P2B. Значительные генетические различия наблюдались между 10 спорадическими штаммами и штаммами, соответствующими группам A, B и D. Среднее генетическое расстояние составляло 0,64 (от 0,42 до 0,88) (рисунок 4). Три спорадических штамма были генетически близки к штаммам группы А со средним генетическим расстоянием 0,02. Один спорадический штамм, разделяющий последовательность VP1 / P2B с штаммами группы D, имел генетическое расстояние 0,08, что указывает на его близкую генетическую связь с ассоциированной с устрицами вспышкой (рис. 5).

Медиана, объединяющая сетевой анализ, проводилась с использованием штаммов из вспышек A, B и C. Цветовой код был таким же, как на рисунке 1. Штаммы без вспышки (открытые круги) также кодируются цветом в соответствии с вспышкой, с которой они совместно используют последовательности VP1 / P2B.

Цветовой код такой же, как на рисунках 1 и 4. Кроме того, изображено напряжение без вспышки, разделяющее одни и те же последовательности VP1 / P2B (открытый круг).

Обзор данных эпиднадзора, собранных у спорадических больных, не выявил прямых эпидемиологических ассоциаций с вспышками пищевых заболеваний. Десять из 14 спорадических случаев имели место либо в географических условиях, либо в календарных годах, отличных от тех, которые были связаны с событиями, связанными с вспышкой, или были связаны с иностранными поездками. Из четырех оставшихся спорадических случаев, однако, были временные и географические общности со случаями, связанными с вспышкой. Все четыре из этих «спорадических» случаев были генетически связаны с случаями вспышки; три случая, выявленные в 2003 году из округов в штатах Алабама и Вашингтон, генетически связаны с штаммами от вспышек А и В, а другой случай, идентифицированный в 2005 году во Флориде, генетически связан с вспышкой D. Поэтому временные и географические ассоциации в сочетании с генетической связанностью , предполагают, что эти четыре случая, ранее считавшиеся спорадическими, на самом деле были вероятными вспышками.

Наблюдение генетической гетерогенности среди HAV-изолятов, разделяющих последовательность VP1 / P2B, вызвало поиск геномной области, которая была бы подходящей для точного представления филогенетических отношений между штаммами. Анализ трех геномных областей, 5’UTR, 5′-конца VP1 и всего VP1, которые обычно используются для вывода филогенетических связей между штаммами HAV, показал, что ни один из них не точно идентифицировал штаммы вспышки HAV (рисунок 1). Группы B и C неразличимы с использованием 5’UTR (фиг.1B), тогда как варианты из группы A и большинства вариантов группы B были обнаружены сгруппированными вместе с использованием 5′-конца VP1 или всего VP1 (фиг.1C, 1D и 1E). Некоторые варианты из группы B группировались отдельно от большинства вариантов из этой группы, когда области VP1 использовались для филогенетического анализа (фиг.1D и 1E).

Поскольку ни одна из широко используемых субгеномных областей не представляла филогенетических связей между штаммами HAV точно, мы провели сканирование WG. Филогенетические деревья были построены для всех 1370 окон и по сравнению с деревом РГ. Анализ показал, что все окна генерируют деревья, одинаково не совместимые с деревом РГ (рис. 6). Однако анализ более длинной области в положениях 2810-4510 (длиной 1700 нс), охватывающий 3′-конец VP1 через большую часть P2C, привел к четкому разделению штаммов вспышки и 14 спорадических штаммов (рис. 7). Тем не менее филогенетические деревья, построенные с использованием P2C и WG, полностью не совпадали (данные не показаны).

Анализ топологии деревьев с использованием скользящего окна (500 нт). Деревья, построенные для каждого окна, сравнивались с эталонным деревом, содержащим последовательности WG из каждой вспышки.

Филогенетический анализ области HAV VP1-P2C проводили с использованием всех штаммов вспышки HAV. Образцы, относящиеся к каждой вспышке, кодируются цветом.

Генетический анализ последовательностей WG показал, что варианты HAV, идентифицированные из пищевых вспышек, являются гетерогенными, хотя и тесно связанными, несмотря на совместное использование последовательностей перехода VP1 / P2B. Степень генетического разнообразия среди вариантов HAV из одной вспышки различалась, причем последовательности WG HAV различались на сайтах до 23 нт среди вспышек лука и устрицы. Варианты последовательности HAV, идентифицированные в каждой вспышке, принадлежали более чем одному штамму. Хотя в вспышке А обнаружен только один доминирующий штамм, в трех других вспышках, связанных с потреблением зеленого лука или устриц, было выявлено от двух до трех доминирующих штаммов. Кроме того, каждая вспышка ассоциировалась со многими миноритарными штаммами (рис.1).

Происхождение такого разнообразия среди вариантов HAV в каждой вспышке неизвестно. Можно предположить, что наблюдаемая генетическая гетерогенность отражает разнообразие вирусных штаммов, циркулирующих в географическом местоположении источника причастных пищевых продуктов, а не генерацию вирусных вариантов от одного предка HAV в ходе заражения каждого хозяина. Наличие более чем одного доминирующего штамма в вспышках B, C и D поддерживает гетерогенные источники HAV, а не получение идентичных замещений одним источником-штаммом в группах инфицированного пациента. Однако, возможно, что один из доминирующих вариантов в каждой вспышке представляет собой наследственный штамм; тогда другие доминирующие варианты вспышек B, C и D могли возникнуть из-за деформации предков через обширную параллельную эволюцию у нескольких инфицированных пациентов. Хотя такое частое, независимое получение идентичных замещений кажется маловероятным даже при сильных давлениях отбора. В качестве альтернативы наблюдаемое генетическое разнообразие могло быть разработано с помощью цепочки передач. Следует отметить, что во время вспышки C загрязненный лук потреблялся в одном ресторане в течение нескольких дней [17], что противоречит существованию широко распространенных цепочек передачи. Таким образом, тесная генетическая взаимосвязь между штаммами HAV, обнаруженная в каждой вспышке, скорее всего, вызвана вирусной эволюцией среди многих хозяев в регионе, где возникла зараженная пища.

Потребление продуктов питания, загрязненных разнообразной популяцией HAV, может привести к совместному заражению каждого человека более чем одним штаммом HAV. Обнаружение разнообразия HAV внутри хоста, о котором сообщалось ранее [26], [27], похоже, подтверждает это предположение. Тем не менее, генетический анализ вариантов HAV внутриголоса у лиц, участвующих в связанной с луком вспышке B, показал отсутствие обнаруживаемого генетического разнообразия внутри хозяина. Пищевые продукты, связанные с изученными здесь вспышками, обычно промывают во время подготовки, таким образом разбавляя вирусный пул. Хотя HAV толерантен к неблагоприятным условиям окружающей среды в течение длительных периодов времени [22], [28], [29], он примерно в 100 раз меньше инфекционным путем пероральной, чем внутривенная инокуляция, как было показано при экспериментальных инфекциях нечеловеческих приматов [30]. Таким образом, наблюдаемая гомогенность внутри хозяина может быть объяснена воздействием каждого человека на ограниченное количество вирусных частиц, из которых один вариант или несколько вариантов успешно установили продуктивную инфекцию. Существование гетерогенности HAV внутри хозяина не изучалось широко в этом исследовании. Однако в недавних публикациях сообщалось о гетерогенности HAV внутри хозяина у инфицированных пациентов [26], [27], в отличие от наших результатов. Хотя это расхождение может быть связано с различиями в применяемой экспериментальной методологии для обнаружения гетерогенности внутри хозяина, оно также может указывать на изменение числа вариантов HAV, устанавливающих инфекцию у облученных лиц. Можно ожидать, что воздействие крупной инокуляции HAV из сырых сточных вод приведет к продуктивной инфекции гетерогенным HAV-популяцией. Напротив, воздействие небольшого количества вирусных частиц, как и на зараженное питание, скорее приведет к продуктивной инфекции однородной популяцией. Таким образом, анализ гетерогенности внутри хозяина может дать важные подсказки для характеристики потенциальных мод передачи HAV. Дальнейшие молекулярные исследования вариантов HAV от вспышек, связанных с различными вирусными источниками, гарантируют выявление связи между разнообразием HAV внутри хоста и режимами передачи.

Анализ последовательностей WG дает более полную генетическую характеристику штаммов HAV, чем короткие субгеномные области. В этом исследовании генетическая идентификация HAV была более точно определена с использованием последовательностей WG. Десять из 14 спорадических штаммов HAV, которые разделяли область VP1 / P2B со штаммами вспышки, были четко отделены от этих штаммов (фиг.4). Однако 4 спорадических штамма были генетически близки к штаммам с 2 вспышек, что указывает на их связь со вспышками, несмотря на отсутствие четкой эпидемиологической ассоциации между этими спорадическими и вспышечными штаммами.

Молекулярный анализ показал, что ни одна из областей 500 нт точно не отражает генетическую связанность между штаммами HAV, что предполагает осторожное использование субгеномных областей для молекулярного отслеживания передач. Однако следует отметить, что отслеживание не требует оценки полных филогенетических отношений и явно основано на идентификации генетической близости или идентичности. Кроме того, высокая распространенность инфекции с генетически связанными вариантами HAV во время эпидемиологически выявленных вспышек значительно снижает вероятность ложного обнаружения трансмиссий, что позволяет разумно эффективно использовать субгеномные регионы. Идентификация штаммов HAV-спорадических и outbreak-вирусов, разделяющих область VP1 / P2B, указывает на то, что следящие передачи с использованием субгеномных областей могут вводить в заблуждение при применении к штаммам HAV с неизвестной эпидемиологической ассоциацией. Эти данные показывают, что исследования должны проводиться с использованием последовательностей HAV WG.

Авторы выражают благодарность государственным департаментам здравоохранения штата Пенсильвания, Теннесси, Северной Каролины и Грузии за их незаменимые усилия по расследованию вспышки гепатита А, связанной с потреблением зеленого лука в 2003 году, и государственными департаментами здравоохранения штата Алабама, штат Флорида, Южная Каролина и Теннесси за их критическую помощь во время вспышки с участием сырых устриц в 2005 году. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников Центров по контролю и профилактике заболеваний и местных должностных лиц общественного здравоохранения за сбор образцов и интервью с пациентами с гепатитом А идентифицированных через наблюдение за Стражными Странами в отношении острого вирусного гепатита (округ Пирс, штат Вашингтон, округ Джефферсон, штат Алабама, округ Пинеллас, штат Флорида) и проекты по надзору за инфекционными заболеваниями (Сан-Диего, Калифорния).



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий